Un hito científico: Descubrimiento del segundo código genético

 

6 mayo 2010 — A veces es difícil valorar las consecuencias de un descubrimiento científico en el momento de su publicación, pero el que se comunica hoy desde la cubierta de Nature puede tener la misma importancia que el descubrimiento del código genético. Esta influyente revista científica informaba del descubrimiento de un segundo código genético —el «código dentro del código»— que acaba de ser descifrado por biólogos moleculares e informáticos teóricos. Además, recurrieron a la tecnología de la información —no a la teoría de la evolución— para el descifrado.

 

Monumento en Poznán dedicado a los criptólogos polacos cuyos trabajos de descifrado de la máquina encriptadora alemana Enigma, comenzados en 1932, alteraron el curso de la Segunda Guerra Mundial. El descifrado del código del splicing ha abierto las puertas a la resolución del enigma planteado por la aparente insuficiencia del código genético ante la riqueza de materiales y organización del organismo. Imagen: Ziko

 

El nuevo código se llama Código de Splicing (o, de corte y empalme, o ajuste). Existe incorporado en el interior del ADN. Dirige al código genético primario, de unas maneras muy complejas pero ahora predecibles, acerca de cómo y cuándo ensamblar genes y elementos de regulación. El descifrado de este código dentro de un código está ayudando a elucidar varios antiguos misterios acerca de la genética que se plantearon como consecuencia del Proyecto del Genoma Humano: ¿Por qué hay sólo 20.000 genes para un organismo tan complejo como el del ser humano? (Los investigadores habían esperado encontrar muchísimos más.) ¿Por qué los genes están fragmentados en segmentos (llamados exones), separados por elementos no codificantes (llamados intrones), que luego se empalman después de la transcripción? ¿Y por qué los genes se activan en algunos tipos de células y tejidos, pero no en otros? Durante dos décadas los biólogos moleculares han intentado desentrañar los mecanismos de regulación génica. Este importante trabajo constituye un hito en nuestra comprensión de lo que está sucediendo. No da respuesta a todas las preguntas, pero demuestra la existencia de un código interno —un sistema de comunicación que se puede descifrar con tanta claridad que los científicos podrían predecir con una asombrosa exactitud lo que el genoma haría en ciertas situaciones.

Imaginemos que estamos oyendo una orquesta en una estancia adyacente. Abrimos la puerta y miramos en el interior, y nos encontramos que hay sólo tres o cuatro músicos que están produciendo todos aquellos sonidos. Esta es la apariencia que según el codescubridor Brendan Frey presenta el genoma humano. Sólo se encontraron 20.000 genes, pero sabíamos que se estaba produciendo una inmensa batería de productos proteicos y de elementos reguladores. ¿Cómo? Un método es el splicing alternativo (empalme alternativo). Se pueden ensamblar diferentes exones (elementos constitutivos de genes) en diferentes formas. Decía Frey: «Por ejemplo, tres genes neurexina pueden generar más de 3.000 mensajes genéticos que ayudan a controlar el conexionado del cerebro». El artículo explica ya desde el principio que se sabe que el 95% de nuestros genes presentan empalme alternativo, y en la mayoría de los casos las transcripciones se expresan de manera diferente en diferentes tipos de células y de tejidos. Debe existir algo que controle cómo se ensamblan y expresan estos miles de combinaciones. Esta es la tarea del Código de Splicing.

La prensa de divulgación presenta resúmenes accesibles y populares, como Science Daily: «Investigadores descifran el “códigó de empalme”, y resuelven un misterio subyacente a la complejidad biológica». Y dice el artículo: «Investigadores en la Universidad de Toronto han descubierto una perspectiva fundamentalmente nueva acerca de cómo las células vivas usan un número limitado de genes para generar órganos enormemente complejos como el cerebro». En la misma revista Nature, Heidi Ledford abría el fuego con un artículo titulado «El código dentro del código».¹ Tejedor y Valcárcel seguían con «Regulación génica: El descifrado del segundo código genético».² Luego, el plato principal era el artículo redactado por el equipo de la Universidad de Toronto dirigido por Benjamin J. Blencowe y Brendan J. Frey, «El descifrado del código de empalme».³

Este artículo es un triunfo de la ciencia de la información, con reminiscencias de los tiempos de los criptoanalistas de la Segunda Guerra Mundial. Entre los métodos utilizados se incluyen la aplicación de álgebra, geometría, teoría de la probabilidad, cálculo vectorial, teoría de la información, optimización de códigos, y otros avanzados métodos. Una cosa que no necesitaron fue la teoría de la evolución, que ni tan solo se menciona en el artículo.⁴ El resumen introductorio reverbera con la tensión dramática de una vivaz obertura:

Aquí describimos el ensamblaje de un «código de empalme», que usa usa combinaciones de cientos de secuencias de ARN para predecir cambios tejido-dependientes en splicing alternativo para miles de exones. El código determina nuevas clases de patrones de splicing, identifica programas reguladores definidos en diferentes tejidos, e identifica secuencias reguladoras verificadas por mutaciones. Se manifiestan unas estrategias de regulación muy generalizadas, incluyendo el uso de unas combinaciones inesperadamente grandes de características, el establecimiento de niveles bajos de inclusión de exones que quedan superados por factores en tejidos específicos, la aparición de factores que van más profundamente dentro de intrones de lo que se había apreciado hasta ahora, y la modulación de niveles variantes de empalme mediante características de la estructura de la transcripción. El código detectó una clase de exones cuya inclusión silencia la expresión en tejidos adultos al activar una degradación del ARN mensajero mediada por mutación terminadora, pero cuya exclusión promueve la expresión durante la embriogénesis. El código facilita el descubrimiento y la caracterización detallada de sucesos regulados de splicing alternativo a escala global del genoma.

El equipo interdisciplinar que descifró el código consta de especialistas del Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática así como del Departamento de Genética Molecular —y Frey trabaja para el el departamento de investigación de Microsoft. A semejanza de los criptoanalistas antiguos, Frey y Barash desarrollaron «un nuevo método de análisis biológico asistido por ordenador que encuentra “palabras código” ocultas dentro del genoma». Recogiendo grandes cantidades de datos generados por los genéticos moleculares, el grupo realizó la «retroingeniería» del código de empalme hasta que pudieron predecir cómo iba a actuar. Cuando comenzaron a saber manejarlo, hicieron pruebas mediante mutaciones, y observaron cómo los exones eran insertados o eliminados como ellos predecían. Descubrieron que este código puede incluso causar cambios tejido-específicos, o actuar de forma diferente cuando el ratón es un embrión o está en el estadio adulto. Un gen, el Xpo4, está implicado en cáncer; Observan ellos que «estos descubrimientos respaldan la conclusión de que la expresión del Xpo4 debe ser estrechamente controlada de modo que esté activo durante la embriogénesis pero subregulados en tejidos adultos, para evitar posibles consecuencias deletéreas, incluyendo la oncogénesis» (cáncer). Parece que quedaron atónitos ante el nivel de control que estaban observando. Con intención o sin ella, Frey utiliza el lenguaje del diseño inteligente —no el de una variación y selección aleatorias— como la clave de su planteamiento: «Comprender un sistema biológico complejo es como comprender un circuito electrónico complejo».

Por su parte, Heidi Ledford afirmaba que la aparente sencillez del código genético de Watson-Crick, con sus cuatro bases, codones de tripletes, 20 aminoácidos y 64 «palabras» de ADN, oculta un universo de complejidad debajo de su superficie.¹ El código de empalme dentro del código es mucho más complejo:

Pero entre el ADN y las proteínas se interpone el ARN y un mundo de complejidad en expansión. El ARN es un ente polimórfico que a veces es portador de mensajes genéticos y que a veces los regula, adoptando una multitud de estructuras que pueden afectar a su función. En un artículo publicado en este número (véase página 53), un equipo de investigadores dirigido por Benjamin Blencowe y Brendan Frey de la Universidad de Toronto en Ontario, Canadá, se comunica el primer intento de definir un segundo código genético: uno que predice cómo los segmentos de ARN mensajero transcritos de un gen determinado pueden ser mezclados y ajustados para conseguir múltiples productos en diferentes tejidos, un proceso llamado splicing alternativo. Esta vez no tenemos una tabla simple —en su lugar tenemos algoritmos que combinan más de 200 elementos diferentes del ADN con predicciones de la estructura del ARN.

Esta investigación pone de relieve el rápido progreso que los métodos de computación han experimentado en el modelado del paisaje del ARN. Además de comprender el splicing alternativo, los métodos informáticos están ayudando a los investigadores a predecir estructuras de ARN, y a identificar las dianas de pequeños fragmentos de ARN que no codifican proteínas. «Es un tiempo apasionante», dice Christopher Burge, un bioinformático en el Instituto Tecnológico de Massachusetts en Cambridge. «En estos próximos años vamos a ver como se progresa enormemente».

Informática — bioinformática — algoritmos y códigos — estos conceptos nunca formaron parte del vocabulario de Darwin en el desarrollo de su teoría. Mendel desarrolló un modelo computacional enormemente simplificado acerca de cómo los caracteres podían segregarse y combinarse en la transmisión de la herencia, pero incluso en su caso la idea de que los rasgos estaban codificados tuvo que esperar a ser descubierta en 1953. Ahora vemos que el código genético original está él mismo sujeto a un código incorporado todavía más complejo. Estas son unas ideas revolucionarias. Y hay indicios de que existen aun otros niveles de control. Por ejemplo, como nos lo recuerda Ledford, el ARN y las proteínas tienen una estructura tridimensional. Las funciones de las moléculas pueden cambiar cuando cambia su forma. Debe haber algún factor que controle el doblado de modo que la estructura en 3D funcione según la función deseada. Por otra parte, el acceso a los genes parece estar regulado por otro código, el código de histonas, que está codificado por marcadores moleculares o «colas» en las proteínas de histonas que sirven como núcleos para el enrollado y superenrollado del ADN. Ledford se refería a un «renacimiento en marcha de la informática del ARN» que está caracterizando a nuestro tiempo.

Tejedor y Valcárcel están de acuerdo acerca de que la complejidad ocultada bajo la simplicidad.² «Así de entrada, todo parece muy sencillo: el ADN produce ARN, que luego produce proteínas», comienzan diciendo. «Pero la realidad es mucho más compleja». En la década de 1950 aprendimos que el código genético básico está compartido por todos los seres vivos desde las bacterias hasta los humanos. Pero pronto se hizo evidente que había un factor extraño, contraintuitivo, en los organismos complejos (eucariontes): sus genomas estaban interrumpidos por intrones que tenían que ser eliminados mediante recorte para poder empalmar los exones. ¿Por qué? Ahora la niebla se está levantando, según nos explican: «Una ventaja de este mecanismo es que permite a diferentes células escoger medios alternativos de corte y empalme [splicing] de pre-ARNm y con ello generar diversos mensajes a partir de un solo gen», «Los ARNm variantes pueden luego codificar diferentes proteínas con funciones diferentes.» Se consigue más información a partir de menos código —siempre y cuando se tenga un código dentro del código que dirija cómo hacerlo.

Lo que hace tan difícil descifrar el código de empalme es que los factores que controlan cuáles son los exones que se reúnen se determina a partir de factores múltiples: secuencias adyacentes a los límites de los exones, secuencias en los intrones, y factores de regulación que o bien asisten o bien inhiben la maquinaria de corte y empalme. Y no sólo esto: «los efectos de una secuencia o factor determinados pueden variar dependiendo de su ubicación relativa a los límites intrón-exón u otros factores reguladores», explican Tejedor y Valcárcel. «Así, el problema es calcular el álgebra de una miríada de secuencias reguladoras y las relaciones mutuas entre los factores reguladores que los reconocen, para predecir el splicing específico de tejido».

A fin de resolver este rompecabezas, el equipo alimentó al ordenador con grandes cantidades de datos sobre secuencias de ARN y las condiciones bajo las que se formaban. «Luego se pidió al ordenador que identificase la combinación de factores que pudieran ser la mejor explicación de la selección de exones específica de tejidos determinada experimentalmente.» En otras palabras, realizaron la retroingeniería del código. Como los criptoanalistas de la Segunda Guerra Mundial, una vez llegaron a determinar el algoritmo, pudieron realizar predicciones: «Este método identificaba correctamente exones alternativos, y predecía su regulación diferencial entre pares de tipos de tejidos con una precisión considerable». Y, como corresponde a una buena teoría científica, este descubrimiento condujo a nuevas percepciones: «Esto permite la reinterpretación de la función de secuencias reguladoras previamente definidas y sugiere propiedades previamente desconocidas de reguladores conocidos así como unas vinculaciones funcionales inesperadas entre ellos», añaden ellos. «Por ejemplo, el código infería que la inclusión de exones que llevan a proteínas truncadas es un mecanismo común de control de la expresión génica durante la transición entre tejidos embrionarios y adultos».

Tejedor y Valcarcel consideran que la publicación de este artículo es un importante primer paso: «que revela el primer fragmento de una Piedra de Rosetta mucho mayor que se necesita para interpretar los mensajes alternativos de nuestros genomas». Prosiguen diciendo que, sin duda alguna, investigaciones futuras mejorarán nuestro conocimiento de este nuevo código. En sus conclusiones, se referían brevemente a la evolución de una manera muy curiosa: no para decir que la evolución produjo estos códigos, sino que el progreso necesitará comprender cómo interaccionan estos códigos. Otra sorprendente posibilidad es que el grado de conservación que se ha visto hasta ahora suscita la posibilidad de unos «códigos específicos de cada especie»:

Este código opera probablemente en un modo autónomo de la célula, y, consiguientemente, puede que tenga que dar cuenta de más de 200 tipos de células en los mamíferos. También tendrá que tratar con la extensa diversidad de patrones alternativos de corte y empalme más allá de unas simples decisiones de inclusión o salto de un exón simple. La limitada conservación evolutiva de la regulación del splicing alternativo (que se estima en alrededor del 20% entre humanos y ratones) plantea la cuestión de códigos específicos de especies. Además, el acoplamiento entre el procesamiento del ARN y la transcripción génica ejerce influencia sobre el splicing alternativo, y recientes datos implican el empaquetamiento del ADN con proteínas histonas y modificaciones covalentes de las histonas —el código epigenético— en la regulación del corte y empalme. Así, en futuros estudios será necesario formular con precisión la interacción entre el código de histonas y el de splicing. Lo mismo es de aplicación a la influencia todavía mal comprendida de las complejas estructuras del ARN sobre el splicing alternativo.

Códigos, códigos y más códigos. El casi silencio acerca del darwinismo en estos artículos sugiere que los teóricos evolucionistas de la vieja escuela tendrán mucho que reflexionar tras leer estos artículos. Mientras, los entusiasmados acerca de la biología de los códigos estarán en la frontera del saber. Pueden jugar con un interesante programa de la Web que los criptoanalistas han creado para estimular futuras investigaciones. Se puede encontrar en el portal de la Universidad de Toronto, llamado WASP – «Website for Alternative Splicing Prediction [Sitio web para la predicción del splicing alternativo]». Los visitantes buscarán aquí en vano algo relativo a la evolución, a pesar de la desgastada máxima de que nada en biología tiene sentido sin ella. Una nueva versión para la década de 2010 podría ser: «Nada en biología tiene sentido excepto a la luz de las ciencias de la computación».

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1. Heidi Ledford, «The code within the code», Nature 465, 16-17 (06 mayo 2010) | doi:10.1038/465016a.

2. J. Ramón Tejedor y Juan Valcárcel, «Gene regulation: Breaking the second genetic code», Nature 465, 44-46 (06 mayo 2010) | doi:10.1038/465045a.

3. Yoseph Barash, John A. Calarco, Weijun Gao, Qun Pan, Xinchen Wang, Ofer Shai, Benjamin J. Blencowe y Brendan J. Frey, «Deciphering the splicing code», Nature 465, 53-59 (06 mayo 2010) | doi:10.1038/nature09000.

4. La «conservación» de la información se menciona varias veces, pero se refiere sólo a una medida de semejanza de secuencia entre especies, p. ej., entre los genomas del ratón y el humano. La conservación no tiene sentido evolutivo sin dar la evolución como supuesto.

Nos complace publicar esta nota dos días sólo después de su publicación en inglés. Este puede que sea uno de los artículos científicos realmente trascendentales de este año. (Naturalmente, cualquier gran descubrimiento va rodeado del trabajo de muchos otros equipos de investigación, como fue el caso de la investigación de Watson y Crick.) Toda esta investigación deja al lector con una sensación de maravilla. Más aun, aquí tenemos una asombrosa confirmación de un designio, y un reto ineludible para el imperio darwinista. Será interesante ver cómo intentan reformular su simplista historia decimonónica de mutación y selección aleatorias a la luz de estos descubrimientos. Debemos ver la significación de lo que dicen Tejedor y Valcárcel: las especies puede que tengan sus códigos «específicos de especie». Y añaden: «en futuros estudios será necesario formular con precisión la interacción entre el código de histonas [epigenético] y el de splicing». Si traducimos esto, significa: «Los darwinistas no pueden participar; desde una perspectiva darwinista coherente, no tienen capacidad para hacer frente a esto». Si el antiguo descubrimiento más simple realizado por Watson y Crick del código genético ya fue un desafío objetivo para el darwinismo, ¿qué hay ahora con el código de corte y empalme, o de splicing, que genera miles de transcripciones procedentes de los mismos genes, y del código epigenético que controla el contexto de la expresión génica, y quién sabe cuántos otros códigos que pueden estar implicados en esta increíble «interacción» que sólo ahora hemos comenzado a leer, como una Piedra de Rosetta que enseña su parte superior por encima de la arena?

Ahora que estamos pensando en términos de códigos y de informática, vienen a la mente toda clase de nuevos paradigmas para la investigación. ¿Y si el genoma actúa en parte como una red de área de almacenamiento? ¿Y si hay criptografía en marcha, o algoritmos de compresión? Deberíamos estar pensando acerca de avanzados sistemas de información y de tecnologías de almacenamiento de información. Quizá encontraremos también hasta alguna esteganografía. No cabe duda que hay mecanismos adicionales para dar robustez, como copias de seguridad y recuperación —quizá esto ayude a explicar los pseudogenes. Las duplicaciones de genomas enteros pueden ser respuestas a estres. Algunas de estas cosas pueden resultar como útiles marcadores para sucesos históricos que no tengan nada que ver con una descendencia común universal, sino que abren la genómica comparada en términos de informática y de diseño para la robustez, y una vía a la comprensión de enfermedades.

A los darwinistas les esperan días difíciles, en los que, como es tradición, intentarán negar lo evidente. Los descubridores intentaron mutar el código y lo que consiguieron fueron cánceres y errores. ¿Cómo se podrá navegar por un paisaje de aptitud ahora, cuando es un campo de minas de catástrofes que esperan suceder cuando uno empieza a manosear todos estos códigos interrelacionados? Sabemos que hay incorporada una cierta robustez y tolerancia, pero la imagen que aparece es de un sistema sumamente complejo, diseñado y optimizado de información —no una disposición aleatoria de componentes que se pueda toquetear sin fin. La misma idea de código pertenece a un concepto de diseño deliberado, inteligente. A. E. Wilder-Smith solía enfatizar esto. Un código implica un convenio entre dos partes. Convenio —de convenir, o «venir juntos»— es un acuerdo por adelantado. Implica planificación y propósito. El símbolo SOS, decía Wilder-Smith, lo usamos por convenio como una señal de apuro. SOS, por sí mismo, no parece tener nada que ver con un apuro. No huele a apuro. No da la sensación de apuro. Nadie sabría que significa que se está en un apuro a no ser que participen en el convenio. Del mismo modo, el codón para alanina, GCC, no parece, huele a, o se siente como alanina. No tendría nada que ver con la alanina excepto si hubiera un convenio previamente acordado entre dos sistemas de codificación: el código de las proteínas y el código del ADN: «GCC significará alanina». Para comunicar este convenio se emplea una familia de traductores, las aminoacetil-ARNt-sintetasas, para traducir un código al otro.

Esto ya debiera haber decidido el caso en favor del designio en la década de 1950, y muchos creacionistas lo argumentaron de forma convincente. Pero los evolucionistas son como vendedores de palabra fácil. Comenzaron a urdir historias y cuentos acerca de un código formado al azar y de creación de nuevas especies por mutación y selección natural, y convencieron a muchos de que pueden darse milagros de puro azar. Bien, estamos en 2010, y tenemos el código epigenético y el código de splicing, dos códigos mucho más complejos y dinámicos que el simple código de ADN. Tenemos códigos dentro de códigos, códigos por encima y por debajo de códigos —una jerarquía de códigos. La acumulación de pruebas contra las tesis materialistas es tan abrumadora que cambia todo el juego. La era de la información ha crecido y se ha desarrollado cercándolos todo alrededor, y objetivamente el darwinismo está totalmente ahogado bajo el peso de la prueba de un diseño deliberado, concatenado, en toda una cascada de sistemas de información que tienen su única explicación en la plasmación de un propósito creador original lleno de sabiduría e intención.

Triste es decirlo, los materialistas no aceptarán esto; no pueden. Excepto que ocurra un milagro que transforme su hostilidad contra el Dios presentido y esquivado. De hecho, esta misma semana ha estado vertiéndose, desde revistas y diarios controlados por los darwinistas, alguna de la retórica más calumniosa, intolerante y odiosa de la que se ha publicado en los últimos años contra los proponentes del diseño inteligente como explicación del origen de los seres vivos y de todo su entorno en el principio. Precisamente cuando se estaba publicando el artículo sobre el código rector de los patrones de corte y empalme del ARNm. Mediante una propaganda que no tiene que envidiar en nada a la de regímenes de triste memoria, y que por cierto también glorificaban una visión darwinista de la vida, buscan manipular las mentes del público y hacerles creer que mantienen una posición científica. Citamos aquí las palabras del materialista Richard Lewontin, el célebre genetista de la Universidad de Harvard, cuando admitió con toda franqueza en 1997 las verdaderas razones para mantener un discurso materialista que, como queda patente, es en realidad insostenible ante la realidad del mundo creado que nos rodea:

«… tenemos un compromiso previo, un compromiso con el materialismo. No se trata de que los métodos y las instituciones de la ciencia nos obliguen de alguna manera a aceptar una explicación material del mundo fenomenológico, sino al contrario, que estamos obligados por nuestra adhesión previa a las causas materiales a crear un aparato de investigación y un conjunto de conceptos que produzcan explicaciones materiales, no importa cuán contrarias sean a la intuición, no importa lo extrañas que sean para los no iniciados. Además, este materialismo es absoluto, porque no podemos permitir un Pie Divino en la puerta.»

Richard Lewontin, en
New York Review of Books
(9 de enero de 1997, p. 31).

En contraste a esta negación voluntarista de Dios se levanta el testimonio divino acerca del origen del universo y de la vida. En el Evangelio según Juan aparece este testimonio de la creación como plasmación de un propósito en la mente divina y expresado en y por la Palabra o Verbo de Dios:

1 En el principio era el Verbo, y el Verbo era con Dios, y el Verbo era Dios. 2 Este era en el principio con Dios. 3 Todas las cosas por él fueron hechas, y sin él nada de lo que ha sido hecho, fue hecho. 4 En él estaba la vida, y la vida era la luz de los hombres. 5 La luz en las tinieblas resplandece, y las tinieblas no prevalecieron contra ella. 6 Hubo un hombre enviado de Dios, el cual se llamaba Juan. 7 Este vino por testimonio, para que diese testimonio de la luz, a fin de que todos creyesen por él. 8 No era él la luz, sino para que diese testimonio de la luz. 9 Aquella luz verdadera, que alumbra a todo hombre, venía a este mundo. 10 En el mundo estaba, y el mundo por él fue hecho; pero el mundo no le conoció. 11 A lo suyo vino, y los suyos no le recibieron. 12 Mas a todos los que le recibieron, a los que creen en su nombre, les dio potestad de ser hechos hijos de Dios; 13 los cuales no son engendrados de sangre, ni de voluntad de carne, ni de voluntad de varón, sino de Dios.

14 Y aquel Verbo fue hecho carne, y habitó entre nosotros (y vimos su gloria, gloria como del unigénito del Padre), lleno de gracia y de verdad. 15 Juan dio testimonio de él, y clamó diciendo: Este es de quien yo decía: El que viene después de mí, es antes de mí; porque era primero que yo. 16 Porque de su plenitud tomamos todos, y gracia sobre gracia. 17 Pues la ley por medio de Moisés fue dada, pero la gracia y la verdad vinieron por medio de Jesucristo.

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Fuente: Creation·Evolution Headlines – Breakthrough: Second Genetic Code Revealed 6/05/2010
Redacción: David Coppedge © 2010 Creation Safaris – www.creationsafaris.com
Traducción y adaptación: Santiago Escuain — © SEDIN 2010 – www.sedin.org

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Publicado por Santiago Escuain para Boletín de SEDIN el 5/09/2010 12:47:00 AM